Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bezeichnet ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren (Assay). Wie der Radioimmunassay (RIA) gehört auch der ELISA zur Gruppe der Immunassay-Verfahren, basiert aber nicht auf einer Radioaktivitätsmessung, sondern auf einer enzymatischen Farbreaktion und gehört somit zu den enzymatischen Immunadsorptionsverfahren (EIA). Das nachzuweisende Antigen wird anfangs über einen Erstantikörper an eine Mikrotiterplatte adsorptiv gebunden und angereichert, ein Enzym-gekoppelter Zweitantikörper (synonym: Detektionsantikörper) führt dann zur Reaktion eines Farbstoffsubstrates.

Mit Hilfe des ELISA können Proteine (z. B. Antikörper) und Viren, aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zunutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Ein Antikörper wird zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Reporterenzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Das sog. Substrat wird vom Enzym umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag, eventuell auch durch Chemolumineszenz nachgewiesen werden. Die Signalstärke ist eine mit einem Photometer sehr genau bestimmbare Funktion der Antigenkonzentration, so dass ELISA als Mehrfachmessungen ausgeführt auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann. Als Reporterenzyme werden meistens die Meerrettichperoxidase (HRP, von engl. horseradish peroxidase), die Alkalische Phosphatase (AP) oder seltener auch die Glucose-Oxidase (GOD) verwendet. Im Falle der alkalischen Phosphatase wird als Farbstoffsubstrat (synonym: Chromogen) z. B. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) zugegeben, während bei der Peroxidase meistens o-Phenylendiamin (oPD) verwendet wird. Die alkalische Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom farblosen Nitrophenylphosphat ab und es entsteht p-Nitrophenol, welches schwach gelb ist. Die Konzentrationsänderung des durch die enzymatische Reaktion entstandenen Farbstoffs kann nach dem Lambert-Beerschen Gesetz mit einem Photometer verfolgt werden. Die Intensität der Farbe steigt dabei mit der Konzentration des entstandenen Nitrophenols und damit auch der Konzentration des zu bestimmenden Antigens in der Probe im Vergleich mit einer Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen (Standardreihe).