Se déroulant dans le Japon du XVIe siècle, vers la fin de la période Sengoku, le jeu se concentrera sur la lutte millénaire entre la Confrérie des Assassins, qui combat pour la paix et la liberté, et l'Ordre des Templiers, qui désire la paix par le contrôle, du point de vue de deux protagonistes : Naoe, une femme shinobi, et Yasuke, un samouraï africain inspiré du personnage historique du même nom. Les deux personnages se contrôlent différemment et proposent un style de jeu unique, permettant d'aborder les quêtes de plusieurs manières.