La microscopie de seconde harmonique (M2H ou (en) SHIM), aussi appelée « microscopie par génération de seconde harmonique » est basée sur un effet optique non-linéaire connu sous le nom de génération de seconde harmonique (GSH, (en) SHG): on la nomme ainsi souvent "microscopie SHG". Elle a été établie comme un mécanisme de contraste d'imagerie par microscope, utile pour la visualisation de la structure de certains tissus biologiques ou fonctions cellulaire[1], mais aussi de certains cristaux ferroélectriques[2].
Un microscope SHG produit des images dont le contraste est dû aux variations de la capacité d'un échantillon à générer de la lumière d'harmonique deux à partir de la lumière incidente, tandis qu'un microscope optique classique obtient son contraste en détectant les variations de densité optique, de la longueur du trajet ou de l'indice de réfraction optique du spécimen. La SHG requiert une lumière laser intense traversant un matériau de structure moléculaire non-centrosymétrique (qui ne possède pas de centre de symétrie). La lumière SHG émergeant d'un tel matériau correspond exactement à la moitié de la longueur d'onde (fréquence doublée) de la lumière pénétrant dans le matériau. Bien que la microscopie par excitation à deux photons (2PEF) soit également un processus à deux photons, la 2PEF perd de l'énergie lors de la relaxation de l'état excité, alors que la SHG conserve l'énergie. Généralement, un cristal inorganique est utilisé pour produire de la lumière SHG, mais certains matériaux biologiques peuvent être hautement polarisables et s'assembler en grandes structures non centrosymétriques assez ordonnées (longs filaments à symétrie cylindrique). Les matériaux biologiques tels que le collagène, les microtubules (via la tubuline) et les muscles (via la myosine[3]) peuvent produire des signaux de SHG.
La conversion de SHG est généralement déterminée par la condition accord de phase (en). Une configuration courante pour un système d'imagerie SHG comprendra un microscope à balayage laser avec un laser titane-sapphire à blocage de mode comme source d'excitation. Le signal SHG se propage généralement dans le sens direct (celui de la lumière d'excitation), et la détection est alors faite en transmission. Cependant, du signal est aussi émis dans la direction inverse (« épi »), et le signal peut alors également être mesuré en « réflexion » : ceci peut être utile pour des matériaux opaques, ou épais, et une partie de ce signal peut être due à la rétroréflexion du signal émis vers l'avant[4].