Reverse-transcriptase

Reverse-transcriptase (RT) is een enzym dat RNA in copy- of complement DNA (cDNA) kan omzetten wat reverse-transcriptie genoemd wordt. Dit enzym maakt deel uit van het genoom van een retrovirus. De 'gastheercel' is in het algemeen niet in staat deze omzetting van RNA naar DNA te maken. Ook niet-retrovirussen, dsDNA-RT virussen, gebruiken reverse-transcriptase, zoals het hepatitis B virus. Eukaryoten hebben zelf het enzym reverse-transcriptase waarmee DNA-beschadigingen hersteld worden. In prokaryoten komen sequenties voor die coderen voor reverse-transcriptase, dat gebruikt wordt voor de vorming van msDNA. Voor het starten van de DNA-synthese is een primer nodig, die bij bacteriën tijdens de replicatie wordt aangemaakt.^[2]

Reverse-transcriptaseremmers worden gebruikt bij virusinfecties, zoals hiv. Reverse-transcriptase is ook betrokken bij de replicatie van chromosoomeinden (telomerase) en sommige genetische elementen (retrotransposons).

Retroviraal reverse-transcriptase heeft drie biochemisch actieve sequenties:

• (a) RNA-afhankelijke DNA-polymerase activiteit
• (b) Ribonuclease H
• (c) DNA-afhankelijke DNA-polymerase activiteit

Retrovirussen hebben een genoom dat bestaat uit twee strengen 'positief' RNA die direct coderen voor het enzym reverse-transcriptase. Met behulp van dit enzym wordt in de gastheercel een complementaire DNA streng gesynthetiseerd. Dit virale DNA, provirus genoemd, wordt dan in het genoom van de gastheer opgenomen en wordt met de transcriptie in RNA afgeschreven. Het provirus wordt met de celdeling vermenigvuldigd. Op deze wijze kunnen ook nakomelingen van de gastheer besmet zijn met het retrovirus.

Reverse-transcriptasen zijn ontdekt door Howard Temin op de University of Wisconsin–Madison in RSV virions^[3] en onafhankelijk van hem in 1970 geïsoleerd door David Baltimore aan de Massachusetts Institute of Technology uit de twee RNA tumor virussen: R-MLV en opnieuw bij RSV.^[4] Voor hun ontdekkingen kregen ze in 1975 samen met Renato Dulbecco de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde.

Het idee van reverse-transcription was in het begin zeer onpopulair, omdat het het centrale dogma van de moleculaire biologie dat stelt dat DNA getranscribeerd wordt in RNA en vervolgens wordt getransleerd in eiwitten, tegensprak. Echter toen in 1970 de wetenschappers Howard Temin en David Baltimore onafhankelijk van elkaar het enzym reverse-transcriptase ontdekten dat verantwoordelijk is voor de reverse-transcriptie werd eindelijk geaccepteerd dat het mogelijk is dat genetische informatie ook op deze wijze wordt doorgegeven.^[5]

Reverse-transcriptases is uitvoerig bestudeerd bij:

• HIV-1 reverse-transcriptase van human immunodeficiency virus type 1. Deze reverse-transcriptase heeft twee subeenheden met molecuulgewichten van respectievelijk 66 en 61 kDa.^[6]
• M-MLV reverse-transcriptase van het xenotropic murine leukemia virus-related virus. Dit is een enkelvoudig 75 kDa monomeer.^[7]
• AMV reverse-transcriptase van het avian myeloblastosis virus. Dit virus heeft ook twee subeenheden, een 63 kDa subeenheid en een van 95 kDa.^[7]
• Telomerase reverse-transcriptase dat de telomeren van eukaryotische chromosomen herstelt.

Reverse-transcriptase maakt veel fouten tijdens de transcriptie van RNA in DNA, omdat het geen correctiemechanisme heeft. Hierdoor kunnen mutaties zich in het genoom opstapelen. Het commercieel beschikbare reverse-transcriptase van Promega maakt bij 1 op de 17.000 basen voor AMV een fout en 1 op 30.000 basen voor M-MLV.^[8]

1. ↑ Tu X, Das K, Han Q, Bauman JD, Clark AD, Hou X, Frenkel YV, Gaffney BL, Jones RA, Boyer PL, Hughes SH, Sarafianos SG, Arnold E, Structural basis of HIV-1 resistance to AZT by excision, Nat. Struct. Mol. Biol., 17, 10, 1202–9, september 2010, pmid = 20852643, pmc = 2987654, doi = 10.1038/nsmb.1908
2. ↑ (January 1972). RNA-dependent DNA polymerase activity of RNA tumor viruses. I. Directing influence of DNA in the reaction. J. Virol. 9 (1): 116–29. PMID 4333538. PMC 356270.
3. ↑ (June 1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226 (5252): 1211–3. PMID 4316301. DOI: 10.1038/2261211a0.
4. ↑ Baltimore D. (June 1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226 (5252): 1209–11. PMID 4316300. DOI: 10.1038/2261209a0.
5. ↑ (June 1970). Central dogma reversed. Nature 226 (5252): 1198–9. PMID 5422595. DOI: 10.1038/2261198a0.
6. ↑ Ferris, AL, Hizi, A, Showalter, SD, Pichuantes, S, Babe, L (April 1990). Immunologic and proteolytic analysis of HIV-1 reverse transcriptase structure.. Virology 175 (2): 456–64. PMID 1691562. DOI: 10.1016/0042-6822(90)90430-y.
7. ↑ ^{a b} (2012). Improving the thermal stability of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase α-subunit by site-directed mutagenesis. Biotechnol. Lett. 34 (7): 1209–15. PMID 22426840. DOI: 10.1007/s10529-012-0904-9.
8. ↑ Promega kit instruction manual (1999)