Kofaktor je nebeljakovinska spojina, ki je močno ali šibko vezana na protein in je potrebna za biološko aktivnost proteina; najpogosteje so ti proteini encimi. Neaktivni encim, brez kofaktorja, se imenuje apoencim, skupaj s kofaktorjem pa holoencim.[1]
Kofaktor je lahko kovinski ion (npr. Zn2+, Mg2+ in Cu2+), lahko pa tudi organska ali kordinacijska spojina. Organski kofaktorji so velikokrat vitamini ali pa so derivati le-teh. Glede na moč vezave na encime se lahko kofaktorje razdeli v koencime, ki se vežejo šibko, ter prostetične skupine, ki se močno vežejo s kovalentnimi vezmi. Nekateri viri sicer omejujejo termin »kofaktor« na anorganske snovi.[2][3]
Nekateri encimi ali encimski kompleksi potrebujejo za svoje delovanje več kofaktorjev. Primer tega je piruvat dehirogenaza, ki potrebuje za oksidacijo piruvata do acetilkoencima A več kofaktorjev; tiamin difosfat (ThDP), lipoamid, flavin adenin dinukleotid (FAD), magnezijev ion (Mg2+) ter kosubstrata nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) in koencim A.[4]